Độ phân giải và độ phóng đại: Vì sao phóng to hơn chưa chắc đã nhìn thấy nhiều hơn?
Một trong những hiểu lầm phổ biến khi sử dụng kính hiển vi là cho rằng độ phóng đại càng lớn thì hình ảnh càng chi tiết. Thực tế, yếu tố quyết định khả năng quan sát các cấu trúc nhỏ không phải là độ phóng đại, mà là độ phân giải (Resolution) của hệ thống quang học.
Độ phân giải là gì?
Độ phân giải là khoảng cách nhỏ nhất giữa hai điểm mà kính hiển vi vẫn có thể phân biệt chúng là hai điểm riêng biệt. Nếu khoảng cách giữa hai cấu trúc nhỏ hơn giới hạn này, chúng sẽ hòa vào nhau và chỉ xuất hiện như một vật thể duy nhất.
Khi quan sát bằng kính hiển vi, một điểm sáng rất nhỏ trên mẫu vật không được tái tạo thành đúng một điểm mà trở thành một đốm sáng có vùng trung tâm sáng và các vòng sáng tối đồng tâm xung quanh, gọi là đĩa Airy (Airy disk). Nếu hai đĩa Airy nằm đủ xa nhau, mắt người có thể nhận biết chúng là hai vật thể riêng biệt. Ngược lại, khi chúng chồng lấp quá nhiều, hai vật thể sẽ hòa vào nhau và chỉ còn xuất hiện như một đốm sáng duy nhất (hình 1). Đây chính là giới hạn độ phân giải của kính hiển vi.
Điều gì quyết định độ phân giải?
Theo giới hạn nhiễu xạ (Diffraction Limit) của kính hiển vi quang học, độ phân giải phụ thuộc chủ yếu vào hai yếu tố:
– Numerical Aperture (NA) của vật kính: NA càng lớn thì vật kính thu được nhiều ánh sáng hơn và khả năng phân biệt các chi tiết nhỏ càng cao. Điều này cũng giải thích vì sao hai vật kính có cùng độ phóng đại nhưng thuộc các dòng khác nhau (Achromat, Plan, Fluorite, Plan Apo…) vẫn cho chất lượng hình ảnh rất khác nhau.
Hình 2: một vài dòng vật kính của hãng Nikon với NA và chất lượng khác nhau
– Bước sóng ánh sáng: ánh sáng có bước sóng càng ngắn thì khả năng phân giải càng cao.
Có nhiều phương trình đã được xây dựng để mô tả mối quan hệ giữa khẩu độ số (Numerical Aperture – NA), bước sóng ánh sáng (λ) và độ phân giải (Resolution):
(1) Độ phân giải (r) = λ/(2NA)
(2) Độ phân giải (r) = 0,61λ/NA
(3) Độ phân giải (r) = 1,22λ/(NA(obj) + NA(cond))
Trong đó:
- r là độ phân giải;
- NA là khẩu độ số của hệ thống kính hiển vi;
- λ là bước sóng của ánh sáng dùng để tạo ảnh;
- NA(obj) là khẩu độ số của vật kính (objective);
- NA(cond) là khẩu độ số của tụ quang (condenser).
Có thể nhận thấy phương trình (1) và (2) chỉ khác nhau ở hệ số nhân: 0,5 trong phương trình (1) và 0,61 trong phương trình (2). Các phương trình này được xây dựng dựa trên nhiều yếu tố, bao gồm các tính toán lý thuyết của các nhà quang học nhằm mô tả đặc tính hoạt động của vật kính và tụ quang. Vì vậy, chúng không nên được xem là biểu thức có giá trị tuyệt đối trong mọi trường hợp.
Trong một số trường hợp, chẳng hạn như kính hiển vi confocal hoặc kính hiển vi huỳnh quang, độ phân giải thực tế có thể vượt qua giới hạn được dự đoán bởi ba phương trình trên. Ngược lại, các yếu tố như độ tương phản của mẫu thấp hoặc hệ thống chiếu sáng không được căn chỉnh đúng có thể làm giảm độ phân giải. Do đó, trên thực tế, giới hạn độ phân giải tối đa của kính hiển vi quang học thông thường khoảng 0,25 µm khi sử dụng bước sóng trung bình 550 nm và vật kính có khẩu độ số 1,35–1,40
Một điểm đặc biệt cần lưu ý là độ phóng đại (Magnification) không xuất hiện trong bất kỳ phương trình nào. Điều này cho thấy độ phân giải của mẫu chỉ được quyết định bởi khẩu độ số (NA) và bước sóng của ánh sáng chứ không phụ thuộc vào độ phóng đại của kính hiển vi.
Tóm lại, độ phân giải là thông số quan trọng nhất của hệ thống quang học kính hiển vi vì nó quyết định khả năng phân biệt các chi tiết nhỏ của mẫu vật. Mặc dù khẩu độ số (NA) của vật kính là yếu tố ảnh hưởng lớn nhất, độ phân giải còn phụ thuộc vào đặc tính của mẫu, điều kiện chiếu sáng, mức độ hiệu chỉnh quang sai và các kỹ thuật tăng cường tương phản. Hiểu đúng về độ phân giải không chỉ giúp lựa chọn vật kính phù hợp mà còn là nền tảng để khai thác hiệu quả độ phóng đại của kính hiển vi (Useful Magnification) – nội dung sẽ được đề cập trong phần tiếp theo.
Tham khảo: https://www.microscopyu.com/microscopy-basics/resolution
Tìm đọc thêm: useful magnification, point spread function, numerical aperture
NIVINA sẵn kho các dòng Kính Hiển Vi NIKON tại Việt nam như Ei, Ci, Ni, Ji và một số dòng kính khác ngay tại Phòng Demo sản phẩm. Kính mời quý khách ghé thăm để nhận tư vấn chính hãng từ kỹ sư tay nghề cao được đào tạo bài bản từ chính Hãng NIKON.
Ngoài ra chúng tôi có Dịch Vụ Hiệu Chuẩn Quốc Tế các Thiết Bị theo ISO17025:2017 và VILAS1336
Liên hệ zalo/hotline: 086-986-5068
