Độ Sâu Trường Ảnh – Vì Sao Độ Phân Giải Càng Cao Vùng Lấy Nét Càng Mỏng?
Độ sâu trường ảnh
Trong kính hiển vi, khi lấy nét vào một vị trí trên mẫu, không chỉ duy nhất một mặt phẳng được nhìn thấy rõ. Một vùng nhỏ phía trước và phía sau mặt phẳng lấy nét vẫn có thể được xem là đủ rõ để quan sát. Khoảng độ sâu này được gọi là độ sâu trường ảnh – Depth of Field (DOF).
Nếu độ phân giải cho biết kính hiển vi có thể phân biệt những chi tiết theo phương ngang (mặt phẳng XY), thì độ sâu trường ảnh cho biết một vùng có độ dày bao nhiêu theo trục Z vẫn có thể được quan sát rõ nét. Vì vậy, độ sâu trường ảnh đặc biệt quan trọng khi quan sát các mẫu có cấu trúc ba chiều hoặc bề mặt không bằng phẳng.
Hình 1: mô hình độ sâu trường ảnh
Yếu tố ảnh hướng đến độ sâu trường ảnh
Một trong những yếu tố quan trọng nhất là khẩu độ số (NA) của vật kính. Khi NA tăng, vật kính có khả năng thu nhận nhiều tia sáng hơn ở các góc lớn hơn. Điều này giúp cải thiện độ phân giải, nhưng đồng thời làm giảm độ sâu trường ảnh.
Có thể mô tả mối quan hệ này bằng phương trình:
Trong đó:
- dtot: độ sâu trường ảnh;
- λ: bước sóng ánh sáng;
- n: chỉ số khúc xạ của môi trường;
- NA: khẩu độ số của vật kính;
- M: độ phóng đại của vật kính;
- e: giới hạn phân giải của camera.
Điểm đáng chú ý nhất theo phương trình trên, độ sâu trường ảnh giảm rất nhanh vì tỷ lệ nghịch với bình phương của khẩu độ số (1/NA2). trong khi giới hạn độ phân giải theo phương ngang giảm theo tỷ lệ nghịch với lũy thừa bậc nhất của khẩu độ số (1/NA) – tham khảo thêm: độ phân giải. Điều đó có nghĩa là tăng NA ảnh hưởng đến khả năng phân giải theo chiều Z mạnh hơn nhiều so với khả năng phân giải theo XY.
Hình 2: biểu đồ mối liên hệ giữa độ sâu trường ảnh và khẩu độ số NA
Độ sâu trường ảnh trong thực tế không chỉ phụ thuộc vào NA
Về lý thuyết, độ sâu trường ảnh thường được tính dựa trên các thông số như bước sóng ánh sáng, chỉ số khúc xạ môi trường và đặc biệt là khẩu độ số của vật kính. Tuy nhiên, trong thực tế, độ sâu trường ảnh còn chịu ảnh hưởng bởi cách quan sát và điều kiện chiếu sáng của hệ kính hiển vi.
Khi quan sát qua thị kính, mắt người có khả năng điều tiết tiêu cự để bù lại một phần sai lệch. Vì vậy, vùng mẫu được quan sát có thể lớn hơn giá trị độ sâu trường ảnh tính toán. Ngược lại trong kính hiển vi kỹ thuật số, mặt phẳng mỏng của cảm biến camera, cùng với độ phóng lớn của hình ảnh trên màn hình, đều góp phần làm giảm độ sâu trường ảnh.
Bên cạnh đó, điều kiện chiếu sáng cũng ảnh hưởng đến độ sâu trường ảnh. Các công thức lý thuyết thường được xây dựng với những điều kiện nhất định, đó là ánh sáng chiếu vào mẫu có tính không kết hợp (incoherent illumination) và khẩu độ của tụ quang phải lớn hơn so với với kính. Khi làm tăng độ kết hợp (coherence) của ánh sáng, bằng cách giảm NA của tụ quang dần về 0, độ sâu trường ảnh có thể tăng lên tới khoảng 2 lần.
Đặc biệt, với các kỹ thuật quan sát kính hiển vi dựa trên độ tương phản pha, độ sâu trường ảnh thực tế có thể giảm đáng kể so với giá trị được dự đoán bởi phương trình ở trên, và có thể tạo ra các lát cắt quang học cực kỳ mỏng.
Vì vậy, độ sâu trường ảnh trong một hệ kính hiển vi thực tế không nên được xem là một giá trị cố định chỉ phụ thuộc vào NA. Nó là kết quả của sự tương tác giữa vật kính, tụ quang, bước sóng ánh sáng, chỉ số khúc xạ, cảm biến camera, cách quan sát và điều kiện chiếu sáng, cũng như đặc tính của kỹ thuật tạo tương phản được sử dụng.
Kết luận
Độ sâu trường ảnh quyết định độ dày của vùng mẫu có thể được quan sát rõ nét trong một lần lấy nét. Khi tăng NA, độ phân giải được cải thiện nhưng độ sâu trường ảnh giảm đáng kể. Vì vậy, lựa chọn vật kính không chỉ dựa trên độ phóng đại hay độ phân giải, mà còn phải cân nhắc đặc điểm không gian và chiều sâu của mẫu. Đối với các mẫu có cấu trúc ba chiều, những kỹ thuật như Z-stack, Confocal và Extended Depth of Field (EDF) giúp khai thác hiệu quả hơn thông tin theo trục Z.
Đại lý chính hãng Kính hiển vi Sinh học NIKON Nhật Bản – NIVINA.,Co
Liên hệ ngay với chúng tôi – Công ty TNHH NI VINA – để sở hữu các thiết bị của hãng NIKON từ dòng kính Sinh Học đến Dòng Kính hiển vi Công nghiệp
– Hotline: 086-986-5068
– Zalo OA: NI VINA Company (https://zalo.me/nivina)
– Email: marketing@nivina.com.vn
– Địa chỉ:Trụ Sở – Hà Nội: Ô DV3-2.10, Tầng 2, Tòa nhà CT2&3, KĐT Dream Town, đường 70, Tây Mỗ, Nam Từ Liêm, Hà Nội
– Chi Nhánh Hồ Chí Minh: Tầng 3, Số 77 Tân Kỳ Tân Quý, Phường Tân Sơn Nhì, Quận Tân Phú, TP. HCM
Tham khảo: https://www.microscopyu.com/microscopy-basics/depth-of-field-and-depth-of-focus
Tìm đọc thêm: Extended Depth of Field (EDF), incoherent illumination
