Chụp ảnh tế bào sống

Kính hiển vi đảo ngược cơ giới ECLIPSE Ti2-E là chân đế kính hiển vi được khuyến nghị để chụp ảnh tế bào sống – có thể kết hợp với tất cả các tùy chọn confocal và siêu phân giải được nêu chi tiết tại đây. Perfect Focus System 4 (PFS4) là công nghệ khóa tiêu điểm dựa trên phần cứng hàng đầu trong ngành, cho phép chụp ảnh tế bào sống lâu dài mà không bị trôi tiêu điểm và tương thích với cả bình nuôi cấy bằng thủy tinh và nhựa. Một bộ phân phối nước tự động cho các vật kính ngâm nước cũng có sẵn.

Hệ thống chiếu sáng mô-đun Ti2-LAPP cho phép kết hợp một kính hiển vi duy nhất với tối đa năm mô-đun chiếu sáng khác nhau, với các tùy chọn có sẵn cho TIRF, epifluorescence trường rộng và kích thích ánh sáng, bao gồm các thiết bị FRAP và thiết bị micromirror kỹ thuật số (DMD). Có thể định cấu hình nhiều mô-đun chiếu sáng TIRF trên một chân đế duy nhất, cho phép chụp ảnh đa kênh đồng thời với góc TIRF tối ưu cho từng đường laser.

Hệ thống chụp ảnh nội dung cao BioPipeline LIVE được định cấu hình độc quyền trên Ti2-E và bao gồm một vỏ bọc ủ kính hiển vi được ghép nối trực tiếp với lồng ấp nuôi cấy tế bào. Hệ thống bao gồm rô-bốt trao đổi mẫu, cho phép chụp ảnh nội dung cao tự động lên đến 44 mạch khác nhau.

Cường độ chiếu tối đa của một chồng Z được thu thập từ một tế bào nguyên phân sống, thu được bằng máy quét cộng hưởng AX R hoạt động ở tốc độ 15 FPS và độ phân giải pixel là 2048 x 1024. Ống kính vật kính là CFI Plan Apo Lambda 60X Oil, 1,4 N.A.

Nghệ thuật và Khoa học Chụp ảnh tế bào sống

Chụp ảnh tế bào sống đòi hỏi người dùng phải cân bằng cẩn thận các điều kiện chụp ảnh – mục đích là thu thập dữ liệu cần thiết tối thiểu, giúp giảm thiểu nhiễu loạn của hệ thống mô hình. Mặc dù có thể hấp dẫn khi sử dụng nhiều công suất chiếu sáng hơn, phơi sáng máy ảnh lâu hơn, v.v. để có được hình ảnh có tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (SNR) cao hơn, nhưng điều quan trọng là phải hiểu rằng độc tính do ánh sáng có thể làm giảm tính toàn vẹn về mặt sinh lý và khả năng tồn tại liên tục của hệ thống. Hơn nữa, quá trình tẩy trắng bằng ánh sáng áp đặt giới hạn thực tế đối với số lượng photon có thể được chiết xuất từ ​​mỗi chất huỳnh quang trong suốt quá trình thử nghiệm.

Một khía cạnh quan trọng của các thí nghiệm chụp ảnh trực tiếp là kiểm soát các điều kiện môi trường – duy trì hỗn hợp khí, nhiệt độ và độ ẩm chính xác cho hệ thống đang xét. Điều này có thể thực hiện được bằng cách sử dụng một miếng chèn nhỏ hơn ở đầu bệ để ủ hoặc một hệ thống bao quanh lớn hơn bao quanh hầu hết kính hiển vi. Cả miếng chèn trên bệ mẫu và vỏ kính hiển vi lớn hơn được thiết kế cho kính hiển vi Nikon đều có sẵn từ các nhà sản xuất bên thứ ba hàng đầu.

Một yếu tố khác cần cân nhắc là lựa chọn thấu kính vật kính. Thấu kính vật kính dầu có khẩu độ số (NA) cao có thể hoạt động tốt đối với các đặc điểm hình ảnh gần tấm kính phủ trong các tế bào phẳng, nhưng bị quang sai cầu khi chụp sâu hơn vào mẫu. Điều này là do chiết suất (RI) của tế bào/môi trường nuôi cấy thấp hơn so với thủy tinh/dầu. Đối với các ứng dụng hình ảnh sâu hơn và 3D, nên sử dụng các vật kính sử dụng phương tiện ngâm phù hợp hơn với RI của môi trường hình ảnh, chẳng hạn như nước hoặc silicon.

Dòng vật kính CFI Apochromat Lambda S bao gồm một số thấu kính vật kính ngâm nước, bao gồm CFI Plan Apochromat IR 60XC WI, có NA cao nhất đối với vật kính ngâm nước là NA = 1,27 mà chúng tôi biết. Gần đây hơn, Nikon đã giới thiệu ống kính vật kính Dòng sản phẩm nhúng silicon. Silicone có RI khoảng 1,4, phù hợp hơn với môi trường tế bào trong khi vẫn cho phép NA cao hơn so với ngâm trong nước. Các vật kính này phù hợp để chụp ảnh các hệ thống nuôi cấy 3D như các cơ quan.

Hệ thống Nikon BioPipeline LIVE bao gồm hệ thống ủ loại vỏ kính hiển vi hoàn chỉnh được kết nối liền mạch với máy ủ nuôi cấy tế bào.

Ống kính vật kính Nikon Silicone Immersion Series. Mỗi ống kính này đều có NA cao, khoảng cách làm việc dài và vòng chỉnh sửa có cài đặt phụ thuộc vào nhiệt độ.

Giảm thiểu độc tính của ánh sáng và hiện tượng tẩy trắng ánh sáng ở tế bào sống

Chiếu xạ mạnh theo yêu cầu của các kỹ thuật chụp ảnh dựa trên huỳnh quang vốn có hại cho sức khỏe tế bào, đặc biệt là với các bước sóng năng lượng cao hơn (chuyển sang màu xanh). Vì lý do này, nên sử dụng các chất huỳnh quang từ đỏ đến gần hồng ngoại, mặc dù việc tiếp tục sử dụng các chất huỳnh quang màu xanh lá cây phổ biến như EGFP không phải là quá cấm đoán và vẫn hoạt động tốt đối với nhiều ứng dụng chụp ảnh nhiều màu.

Hầu hết các kính hiển vi đều sử dụng phần mềm kích hoạt các thiết bị hệ thống. Tuy nhiên, điều này có thể hơi chậm do đồng hồ máy tính không chính xác tương đối và các lần kiểm tra và gọi lại bắt buộc của trạng thái thiết bị. Ngược lại, kích hoạt phần cứng sử dụng đồng hồ pixel camera có độ chính xác cao để phối hợp các thiết bị trong khi bỏ qua các lần gọi lại của thiết bị, do đó tối đa hóa tốc độ hệ thống trong khi giảm thiểu liều lượng photon. Các thiết bị được kích hoạt có thể bao gồm các giai đoạn áp điện Z, đèn chiếu laser/LED và thậm chí cả các thiết bị tùy chỉnh có khả năng giao tiếp I/O.

Việc kích hoạt phần cứng cải thiện đáng kể thời gian thử nghiệm tổng thể. Trong hầu hết các ví dụ này, thời gian phơi sáng của máy ảnh dài hơn thời gian đọc của máy ảnh.

^a Hàng cuối cùng trình bày một phép so sánh trong đó thời gian phơi sáng của máy ảnh giống với thời gian đọc của nó và máy ảnh có thể chạy ở chế độ chồng chéo (chu kỳ hoạt động 100%).

Sử dụng trí tuệ nhân tạo dựa trên học sâu để cải thiện hình ảnh tế bào sống

Sự ra đời của các phương pháp trí tuệ nhân tạo (AI) dành cho kính hiển vi đã mở ra những khả năng mới cho hình ảnh tế bào sống với liều lượng photon giảm. Các phương pháp dựa trên học sâu đang chứng minh được tính phù hợp đối với các xét nghiệm dựa trên hình ảnh của mẫu vật sinh học. Nikon cam kết phát triển các giải pháp phần mềm ổn định dựa trên học sâu cho nhiều ứng dụng khác nhau – có sẵn dưới dạng các mô-đun NIS.ai cho phần mềm NIS-Elements của chúng tôi.

Clarify.ai cung cấp tính năng tự động loại bỏ hiện tượng nhòe ngoài tiêu điểm khỏi các hình ảnh huỳnh quang trường rộng tiêu chuẩn. Mô-đun này được đào tạo trước tại nhà máy của chúng tôi và không yêu cầu người dùng điều chỉnh thủ công hình ảnh cuối cùng, loại bỏ khả năng chủ quan. Do đó, Clarify.ai cho phép thực hiện phân đoạn quang học trên các hình ảnh trường rộng một mặt phẳng thu được ở tốc độ hệ thống tối đa, không yêu cầu dữ liệu từ nhiều mặt phẳng như với giải mã lặp lại 3D của dữ liệu trường rộng.

Denoise.ai là một mô-đun được đào tạo trước khác và được sử dụng để loại bỏ nhiễu Poisson (nhiễu ảnh) khỏi các hình ảnh cộng hưởng theo thời gian thực. Điều này cho phép giảm thời gian phơi sáng và có lợi khi sử dụng kết hợp với hình ảnh quét cộng hưởng thu được bằng kính hiển vi cộng hưởng AX R, trong đó nhiễu bắn là nguồn nhiễu chủ yếu.

Nikon cũng cung cấp mô-đun Convert.ai để dự đoán các đặc điểm hình ảnh thường được phát hiện trong kênh huỳnh quang, với tín hiệu dự đoán dựa trên hình ảnh trường sáng tương ứng (ví dụ: dự đoán các mẫu nhuộm hạt nhân DAPI từ dữ liệu hình ảnh DIC). Điều này cho phép loại bỏ các kênh hình ảnh huỳnh quang, tránh được ánh sáng mạnh mà các kỹ thuật huỳnh quang yêu cầu. Các kỹ thuật hình ảnh trường sáng vốn ít độc hại với ánh sáng hơn.

Enhance.ai có thể được đào tạo để dự đoán các chi tiết trong hình ảnh có tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (SNR) thấp, cải thiện hiệu quả SNR và cho phép chụp ảnh với liều lượng photon và hiện tượng tẩy trắng ảnh giảm.

Ảnh thô

Dữ liệu trường rộng có thể bị nhiễm ánh sáng phân tán và không rõ nét, nhưng các công cụ dựa trên AI có thể khôi phục hình ảnh có độ tương phản cao bằng cách loại bỏ nhiễu và nhòe.

Bản gốc

Denoise.ai có thể được áp dụng để loại bỏ thành phần nhiễu ảnh trong khi vẫn giữ nguyên cấu trúc cơ bản và các giá trị cường độ.

Kỹ thuật tương phản nào phù hợp với nghiên cứu của bạn?

Đối với các mẫu hai chiều tương đối phẳng, chẳng hạn như các tế bào bám dính được nuôi cấy trong ống nghiệm, hình ảnh huỳnh quang trường rộng có thể đủ. Các trường hợp sử dụng và loại mẫu tương thích rộng hơn nhiều khi kết hợp hình ảnh trường rộng với phân tích giải mã hoặc khử mờ tự động bằng mô-đun phần mềm Clarify.ai.

Hình ảnh cộng hưởng trở nên cần thiết khi hình ảnh các mẫu dày hơn ~20 μm nhưng cũng hữu ích cho hình ảnh có độ phân giải cao của các mẫu thậm chí chỉ dày vài μm. Các thiết bị cộng hưởng đĩa quay nhanh và phù hợp với các mẫu có kích thước lên đến ~50 μm (với CSU-W1 có thể chụp ảnh sâu hơn các mô hình khác do khoảng cách giữa các lỗ kim lớn hơn). Cả hai hệ thống đều có thể áp dụng để chụp ảnh các loại hệ thống nuôi cấy tế bào 3D khác nhau, chẳng hạn như các cơ quan và hình cầu.

Hình ảnh huỳnh quang trường rộng của cầu thận chuột trong phần mô dày 16 mm trước (a) và sau (b) giải mã lặp lại 3D trong phần mềm NIS-Elements.